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上海有机所在硫肽类抗生素的生物合成酶学机制和分子改造研究方面取得重要进展
2016-12-14 生命有机化学国家重点实验室 | 【】【打印】【关闭

  近期,中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室刘文研究员课题组在国际上首次阐明了硫链丝菌素(ThiostreptonTSR)侧环形成过程中关键大环化反应的酶学机制,相关成果已于1124日在线发表于国际著名期刊《美国科学院院报》上(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2016, DOI: 10.1073/pnas.1612607113.)。 

  硫肽抗生素是一类古老的生物活性肽抗生素,该家族成员目前已被发现超过一百余种。虽然此类天然产物的结构复杂、种类多样,但是其生物合成途径却存在共性,即底物均为一段高度后修饰的由核糖体翻译而来的多肽。对于此类抗生素生物合成途径的研究,不但有利于使用经过改造后的“微生物工厂”来生产制备新型的药物前体,还拓展了人们对于特殊蛋白质/多肽翻译后修饰反应的理解和认识。该家族中的硫链丝菌素具有独特的双大环骨架结构和优良的生物活性(包括抗细菌、抗支原体、抗癌、抗疟和免疫抑制等活性),引起了科研人员强烈的兴趣。 

  刘文课题组长期以来致力于硫链丝菌素的生物合成与分子改造的研究中。在前期的工作中,他们基于该分子生物合成途径的特殊性,设计并开发了一套基于“前体导向突变生物合成”的TSR分子改造策略。利用该策略,他们成功获得了多个活性显著超出母体化合物的TSR衍生物,并制备了首个含有氟元素和氯元素的TSR分子(Org. Chem. Front., 2015, 2, 106-109; Org. Chem. Front., 2016, 3, 496-500.)。选用其中的部分衍生物作为化学探针,他们还发现了一种独特的硫肽抗生素杀灭胞内寄生菌的双重作用机制(Chem. Biol., 2015, 22, 1002-1007.),这为未来抗感染药物的研发给出了新的启示。基于上述研究结果,该课题组系统性地阐释了硫链丝菌素的侧环结构与其优良生物活性的构效关系。 

  在最近的研究过程中,他们基于同样的策略使用不同的合成前体对相同的突变菌株进行化学喂养,却发现了与预期产物不一致的硫肽衍生物。在使用前体7-F-QA喂养突变株tsrT时,他们发现了一个侧环结构不完整的氟代TSR衍生物,其中喹萘啶酸(QA)结构单元没有发生相应的氧化后修饰。以此种具备二酮结构特征的TSR流产产物(shunt product)作为预期,他们研究了TSR生物合成途径与分子骨架氧化后修饰相关的基因功能,通过基因敲除/回补、化学喂养、体外酶学测活等手段,最终确定了P450蛋白TsrP负责了TSR侧环形成过程中QA结构单元的环氧化反应(ACS Chem. Biol., 2016, 11, 2673-2678.)。但是至此,由于没有获得侧环关闭过程中的关键中间体,关于硫链丝菌素侧环形成的核心酶学机制还无法得到阐明。 

  而在本研究中,他们继续沿用“前体导向突变生物合成”的策略,通过优化6-F-QA作为前体喂养突变株tsrT后的发酵时间,他们成功分离、鉴定了一个侧环尚未关闭但QA基团已经发生环氧化的关键氟代中间体。正是由于氟原子的引入,降低了催化侧环形成的关键蛋白的酶活,从而导致了这样一个中间体的短暂积累;而继续延长发酵时间,该中间体会被转化为最终成熟的6’-fluoro-TSR分子。该中间体的分离和鉴定为TSR侧环生物合成途径中的酶学机制研究奠定了重要基础。该课题组成员通过生物信息学分析,锁定了TSR生物合成基因簇中一个功能尚未得到归属的基因tsrI,其编码的蛋白TsrI隶属于α/β水解酶超家族。综合使用基因敲除/回补、化学半合成模拟底物制备、体外酶学测活、化学喂养等手段,他们证实了TsrI是硫链丝菌素侧环生物合成过程中的关键蛋白,该蛋白同时负责了先导肽的切除和TSR侧环关闭过程的大环化反应;另外,通过序列比对、同源建模和氨基酸点突变研究,他们还在TsrI中确定了α/β水解酶超家族高度保守的“催化三联体”氨基酸残基(Asp-His-Ser)。虽然目前已有十余种α/β水解酶超家族蛋白的不同活性相继得到了报道,但是同时兼具蛋白内切酶活性和催化游离氨基进行环氧开环活性的“双功能”α/β水解酶在此前的研究中却从未被发现。本研究中关于TsrI功能的阐明,不但解决了长期以来困扰人们的双环硫肽抗生素侧环如何关闭的问题,更拓展了人们对于α/β水解酶这一超家族蛋白生化功能的进一步认识和理解,同时为基于合成生物学策略改造双大环硫肽类抗生素分子结构的研究奠定了基础。 

  上述成果均主要由刘文课题组的在读博士生郑庆飞、副研究员王守锋等完成,并获得了国家自然科学基金委、科技部、上海市科委和中科院等相关项目的大力资助。 

α/β水解酶超家族蛋白TsrI依次催化硫链丝菌素生物合成途径中C-N键断裂和形成的双重活性

 

 

 
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